纪念馆共收藏国家珍贵文物6000余件,其中一级文物300余件,藏品的来源包括出土挖掘、民间征集、社会捐赠等。 馆藏文物中最具代表性的藏品有:中山码头集体屠杀遗址出土的南京大屠杀遇难者遗物,美国牧师约翰·马吉拍摄南京大屠杀暴行时使用的摄像机及胶片,南京国防部审判日本战犯军事法庭庭长石美瑜保存的战犯谷寿夫、向井敏明等人的死刑判决书底稿,中国远征军抗战老兵梅树淇1942年的战地日记,以及分馆南京利济巷慰安所旧址陈列馆中陈列的南京福安里慰安所旧址发现的日军对“慰安妇”使用的妇科检查用具等。